EUR/RUB 67.89
USD/RUB 57.51
EUR/USD 1.18
Банк инноваций
2009, декабрь
2009, ноябрь
2009, октябрь
2009, сентябрь
2009, август
2009, июль
2009, июнь
2009, май
2009, апрель
2009, март
2009, февраль
2009, январь
2008, декабрь
 •  Статья 1
 •  Статья 2
 •  Статья 3
 •  Статья 4
2008, ноябрь
2008, октябрь
2008, сентябрь
2008, август
2008, Июль
2008, Июнь
2008, Май
2008, Апрель
2008, Март
2008, Февраль
Анонсы


Переработка отработанных автомобильных шин

БЮРО ИННОВАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ
 

 
100%
800
960
1024
1152
 О компании  Услуги  Журнал  Контакты 
Журнал  2008, декабрь  Статья 2

 

ИЗМЕНЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ К ГОРМОНАМ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ДИАБЕТЕ У МОЛЛЮСКОВ


Горбачев Артем
Санкт-Петербург, 371 школа, 11 «Г» класс.

Работа выполнена на основе лаборатории молекулярной эндокринологии института эволюционной физиологии и биохимии имени РАН имени И.М.Сеченова

Научный руководитель- доктор биологических наук Шпаков Александр Олегович

2008


Еще недавно считали, что сахарным диабетом могут страдать только человек и некоторые представители млекопитающих (обезьяна, крыса). Однако в последние годы появились данные о возможности развития диабета у других позвоночных и даже беспозвоночных животных, тем более что у них, так же как и у млекопитающих, выявлены все основные компоненты инсулиновой сигнальной системы, повреждения которой являются одной из главных причин диабета.

Создание моделей сахарного диабета у беспозвоночных животных является одним из перспективных подходов для изучения молекулярных основ развития этого заболевания. Необходимость создания и изучения таких моделей связана, в частности, с тем, что некоторые биохимические, физиологические и поведенческие показатели у беспозвоночных контролировать намного легче, чем у млекопитающих, которые являются классическими объектами для создания моделей диабета.

Ранее в лаборатории молекулярной эндокринологии Института эволюционной физиологии и биохимии была создана модель стрептозотоцинового диабета у двустворчатого моллюска Anodonta cygnea. Было показано, что в процессе развития диабетоподобного состояния в мышцах этого моллюска на фоне резкого повышения уровня сахаров в гемолимфе (гипергликемии) снижается ответ гормоночувствительной аденилатциклазной системы к инсулину и другим пептидам инсулинового суперсемейства. Основные нарушения в передаче гормонального сигнала и чувствительности тканей к инсулину отчетливо выявлялись уже через 2 суток после введения моллюскам стрептозотоцина. В дальнейшем, через 4 и 8 суток чувствительность к гормонам начинала восстанавливаться.

В плане создания новых моделей диабетоподобных состояний у беспозвоночных была разработана стрептозотоциновая модель диабета у представителей брюхоногих моллюсков – прудовика Lymnaea stagnalis и катушки Coretus corneus. Экспериментальная модель диабета на брюхоногих моллюсках вызывалась однократным введением им стрептозотоцина в дозе 65 мг/кг веса животного.

Цель работы состояла в изучении чувствительности фермента аденилатциклазы, эффекторного компонента аденилатциклазной сигнальной системы, к гормональным и негормональным активаторам в мышцах и гепатопанкреасе моллюсков со стрептозотоциновым диабетом в сравнении с контрольными животными.

Методика исследования

Животных собирали в ленинградской области. У собранных животных мы извлекали мышцы и гепатопанкреас, после чего полученные органы гомогенизировали. Полученный гомогенат мы два раза центрифугировали. Первый раз при 15000 оборотах в течение 15 минут, а второй раз при 20000 оборотах в течение 30 минут для осаждения плазматических мембран. Полученные мембраны добавляли в инкубационную среду следующего состава: 50 мМ Tris-HCl, pH 7.5, 0.1 мМ АТФ, 1 мМ цАМФ, 20 мМ креатинфосфата, 0.2–0.5 мг/мл креатинфосфокиназы, 5 мМ MgCl2, [a-32P]АТФ добавляли из расчета 1-2 мкКи на пробу. Общий объем пробы составлял 50 или 100 мкл. Определение активности магний-зависимой АЦ (АТФ-пирофосфатлиазы циклизующей, КФ 4.6.1.1) проводили при 30 °C и времени инкубации 10 мин по модифицированному нами методу (Salomon et al., 1974). Реакцию начинали добавлением белка (15–50 мкг), а останавливали внесением в пробу 200 мкл 0.5 М HCl, после чего образцы помещали на 7 мин в кипящую водяную баню, затем в каждую пробу вносили по 200 мкл 1.5 M имидазола и наносили образцы на колонку с окисью алюминия. Образовавшийся в ходе ферментативной реакции цАМФ элюировали с помощью 8 мл 10 мМ имидазол-HCl буфера, pH 7.4. Элюат помещали в сцинтилляционные флаконы и в них измеряли радиоактивность по методу Черенкова на счетчике Rackbeta (LKB, Швеция). Активность АЦ выражали в пмоль цАМФ/мин на 1 мг белка.

Полученные результаты

Одной из задач исследования было изучение динамики нарушений, возникающих в АЦ системе, и способность этой системы к восстановлению сигнал-проводящей функции, для чего были выбраны различные сроки развития диабета – от одних до пяти суток после введения животным стрептозотоцина. Для выяснения того, как в условиях диабетоподобного состояния в тканях моллюсков меняется активность аденилатциклазных сигнальных систем, сопряженных с различными типами G-белков, изучали передачу гормональных сигналов, осуществляемую как через G-белки стимулирующего (Gs-белки), так и ингибирующего типа (Gi-белки).

В мышечных тканях обоих моллюсков через сутки после обработки стрептозотоцином на фоне отчетливо выраженной гипергликемии в сравнении с контролем повышалась базальная активность аденилатциклазы и снижалась ее чувствительность к стимулятору G-белков – GppNHp (негидролизуемому аналогу ГТФ) (табл.1). При более продолжительном развитии диабета (3 и 5 суток) базальная активность АЦ и ее регуляция GppNHp практически не отличались от контроля. Это происходило на фоне существенного снижения уровня сахаров в гемолимфе, который через 3 суток приближался к его значениям в контроле.

В гепатопанкреасе прудовика различия были выражены в большей степени, сохранялись при диабете со сроком развития 3 суток, но мало отличались от контроля через 5 суток после обработки стрептозотоцином (табл.1). В отличие от мышечной ткани прудовика, в гепатопанкреасе наблюдали снижение (а не повышение) базальной активности аденилатциклазы, а также отчетливо выраженное ослабление стимуляции фермента форсколином, который действует непосредственно на фермент.

Таблица 1. Базальная активность аденилатциклазы и ее стимуляция негормональными агентами в мышцах и гепатопанкреасе моллюсков прудовика L. stagnalis и катушки C. corneus с диабетом со сроками развития 1, 3 и 5 сут в сравнении с контрольными животными

ВоздействиеАктивность АЦ, пмоль цАМФ/мин на 1 мг мембранного белка(M ± m)   
 КонтрольДиабет (сут)  
  1 35
L. stagnalis, мышцы
Без воздействий42 ± 2 (100)57 ± 3 (100)46 ± 3 (100)40 ± 4 (100)
GppNHp, 10-6 M155 ± 9 (369)130 ± 8 (228)144 ± 11 (313)149 ± 12 (373)
Форсколин,10-6 M120 ± 4 (286)131 ± 10 (230)125 ± 7 (272)113 ± 6 (283)
L. stagnalis, гепатопанкреас
Без воздействий75 ± 6 (100)59 ± 8 (100)64 ± 3 (100)70 ± 5 (100)
GppNHp, 10-6 M157 ± 8 (209)85 ± 4 (144)ND129 ± 11 (184)
Форсколин,10-6 M210 ± 7 (280)126 ± 11 (214)144 ± 10 (225)186 ± 9 (266)
C. corneus, мышцы
Без воздействий25 ± 1 (100)33 ± 3 (100)26 ± 3 (100)23 ± 1 (100)
GppNHp, 10-6 M69 ± 4 (276)58 ± 2 (176)62 ± 5 (238)63 ± 7 (274)
Форсколин,10-6 M60 ± 2 (240)68 ± 4 (206)64 ± 7 (246)61 ± 6 (265)

Примечание. В скобках приведена активность АЦ в процентах (базальная активность фермента для каждой группы животных принята за 100 %).

Стимулирующие аденилатциклазу эффекты биогенных аминов (октопамина, дофамина и серотонина) и пептидного гормона релаксина, которые действуют через Gs-белки, отчетливо снижались в мышцах обоих видов моллюсков с диабетом продолжительностью 1 и 3 суток (табл.2). Через 5 суток эти эффекты в значительной степени восстанавливались, в случае серотонина – до их уровня в контроле.

Таблица 2. Стимулирующие аденилатциклазу эффекты гормонов в мышечной ткани моллюсков Lymnaea stagnalis (а) и Coretus corneus (б) с диабетом в сравнении с контрольной группой животных.

Гормон Активность АЦ, %   
 КонтрольДиабет (сут)  
  135
(А) L. stagnalis (мышцы)
Октопамин578 ± 31298 ± 17460 ± 12513 ± 39
Дофамин341 ± 19242 ± 14288 ± 11307 ± 17
Серотонин694 ± 29401 ± 26558 ± 35670 ± 28
Релаксин216 ± 9168 ± 9187 ± 12198 ± 11
(Б) C. corneus (мышцы)
Октопамин426 ± 17304 ± 17366 ± 20393 ± 26
Дофамин236 ± 10181 ± 7199 ± 10211 ± 14
Серотонин517 ± 31350 ± 23463 ± 35510 ± 31
Релаксин169 ± 6140 ± 5155 ± 9157 ± 9

А – октопамин, Б – дофамин, В – серотонин, Г – релаксин. 1 – контроль, 2–4 – диабет со сроком развития 1, 3 и 5 суток. Базальная активность фермента принята за 100 %.

Сходные тенденции были выявлены в гепатопанкреасе катушки с той лишь разницей, что стимулирующие аденилатциклазу эффекты биогенных аминов (октопамина и серотонина) в этой ткани снижались в значительно большей степени, чем в мышцах, и даже через 5 суток восстанавливалась только до 60–70 % от их величины в контроле (табл.3). Это указывает на более выраженные нарушения чувствительности к гормонам, действующим на аденилатциклазу через Gs-белки, в гепатопанкреасе моллюсков с диабетом в сравнении с их мышечной тканью.

Таблица 3. Стимулирующие аденилатциклазу эффекты биогенных аминов в гепатопанкреасе C. corneus с диабетом в сравнении с контролем.

Гормон Активность АЦ, %   
 КонтрольДиабет (сут)  
  135
(Б) C. corneus (гепатопанкреас)
Октопамин687 ± 46290 ± 20324 ± 16464 ± 31
Серотонин404 ± 22210 ± 19246 ± 11307 ± 25

А – октопамин, Б – серотонин, 1 – контроль, 2–4 – диабет со сроком развития 1, 3 и 5 суток. Базальная активность фермента принята за 100 %.

В мышцах катушки пептидный гормон соматостатин отчетливо ингибирует стимулированную форсколином активность АЦ (табл.4). В условиях суточного диабета ингибирующий АЦ эффект соматостатина резко ослабляется, но к 5 суткам восстанавливается до его значений в контроле. Таким образом, несмотря на резкое снижение чувствительности к соматостатину сопряженной с Gi-белками аденилатциклазной системы в мышцах катушки на начальных этапах развития диабета, в дальнейшем наблюдается быстрое ее восстановление – частичное через 3 суток и полное через 5 суток после обработки стрептозотоцином.

Таблица 4. Ингибирование соматостатином стимулированной форсколином АЦ активности в мышцах C. corneus с диабетом в сравнении с контролем.

ГормонСтимулирующий АЦ эффект форсколина, %   
 КонтрольДиабет (сут)  
  135
(Б) C. corneus (мышцы)
Соматостатин32 ± 487 ± 665 ± 338 ± 6

1 – контроль, 2–4 – диабет со сроком развития 1, 3 и 5 суток. Стимулирующий АЦ эффект форсколина (10-5 М) в отсутствие соматостатина принят за 100 %, p меньше 0.05 по сравнению с контролем.

Полученные данные свидетельствуют о том, что после обработки стрептозотоцином в тканях моллюсков запускаются процессы восстановления чувствительности аденилатциклазной системы к различным по химической природе гормонам, действующим как через Gs-, так и через Gi-белки. В основе этого лежит выраженная способность к регенерации у беспозвоночных животных тканей, продуцирующих инсулиноподобные вещества. Повышение уровня таких веществ, обладающих гипогликемическим эффектом, приводит к снижению уровня сахаров в гемолимфе. Поскольку гипергликемия является одним из ключевых факторов, ведущих к нарушению функционирования гормональных сигнальных систем, то снижение уровня сахаров способствует восстановлению чувствительности этих систем к гормонам. Так как в нашем случае через трое суток уровень сахаров в гемолимфе диабетических моллюсков снижался до контрольного уровня, можно утверждать, что гипергликемия является одним из ключевых факторов, ведущих к нарушению функционирования аденилатциклазной системы у моллюсков с диабетом.

Выводы

1. В мышцах и гепатопанкреасе моллюсков с диабетом, вызванным обработкой стрептозотоцином, снижался стимулирующий аденилатциклазу эффект гуанилилиимидодифосфата (GppNHp), действующего на гетеротримерные G-белки, а в гепатопанкреасе также снижался стимулирующий эффект форсколина, действующего непосредственно на аденилатциклазу, причем нарушения были наиболее выражены через сутки после развития диабета.

2. У моллюсков со стрептозотоциновым диабетом продолжительности одни сутки отчетливо снижались регуляторные эффекты биогенных аминов и пептидных гормонов, реализуемые как через G-белки стимулирующего (октопамин, дофамин, серотонин, триптамин и релаксин), так и ингибирующего типа (соматостатин). В дальнейшем, через трое и пятеро суток после обработки стрептозотоцином, наблюдалось восстановление этих эффектов. Нарушения в гепатопанкреасе были выражены в большей степени в сравнении с мышцами.




Рис. 1. Стимулирующие аденилатциклазу эффекты гормонов в мышечной ткани моллюсков Lymnaea stagnalis (а) и Coretus corneus (б) с диабетом в сравнении с контрольной группой животных.
А – октопамин, Б – дофамин, В – серотонин, Г – триптамин, Д – релаксин. 1 – контроль, 2–4 – диабет со сроком развития 1, 3 и 5 суток. Базальная активность фермента принята за 100 %.




Рис. 2. Стимулирующие аденилатциклазу эффекты биогенных аминов в гепатопанкреасе C. corneus с диабетом в сравнении с контролем.
А – октопамин, Б – серотонин, В – триптамин, 1 – контроль, 2–4 – диабет со сроком развития 1, 3 и 5 суток. Базальная активность фермента принята за 100 %.




Рис. 3. Ингибирование соматостатином стимулированной форсколином АЦ активности в мышцах C. corneus с диабетом в сравнении с контролем.
1 – контроль, 2–4 – диабет со сроком развития 1, 3 и 5 суток. Стимулирующий АЦ эффект форсколина (10-5 М) в отсутствие соматостатина принят за 100 %. *p


Список литературы

Шпаков А. О., Кузнецова Л. А., Плеснева С. А. И др. Бюл. Экспер. Биол. Мед. 144, 526-530 (2007).
Shpakov A. O., Kuznetsova L.A., Plesneva S. A. et al. Cent. Eur. J. Biol. 1, 530-544 (2006).
Londos C, Salamon Y, Lin MC, Harwood JP, Schramm M, Wolff J, Rodbell M. Anal Diochem. 1974 Apr;58(2):541-8.


 

©2007-2017 Бюро инновационных технологийcms4site™