EUR/RUB 82.63
USD/RUB 76.41
EUR/USD 1.08
Банк инноваций
2009, декабрь
2009, ноябрь
2009, октябрь
2009, сентябрь
2009, август
2009, июль
2009, июнь
2009, май
2009, апрель
2009, март
2009, февраль
2009, январь
2008, декабрь
 •  Статья 1
 •  Статья 2
 •  Статья 3
 •  Статья 4
2008, ноябрь
2008, октябрь
2008, сентябрь
2008, август
2008, Июль
2008, Июнь
2008, Май
2008, Апрель
2008, Март
2008, Февраль
Анонсы


Конструкция пульта управления телевизором, учитывающая различных пользователей

БЮРО ИННОВАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ
 

 
100%
800
960
1024
1152
 О компании  Услуги  Журнал  Контакты 
Журнал  2008, декабрь  Статья 2

 

ИЗМЕНЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ К ГОРМОНАМ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ДИАБЕТЕ У МОЛЛЮСКОВ


Горбачев Артем
Санкт-Петербург, 371 школа, 11 «Г» класс.

Работа выполнена на основе лаборатории молекулярной эндокринологии института эволюционной физиологии и биохимии имени РАН имени И.М.Сеченова

Научный руководитель- доктор биологических наук Шпаков Александр Олегович

2008


Еще недавно считали, что сахарным диабетом могут страдать только человек и некоторые представители млекопитающих (обезьяна, крыса). Однако в последние годы появились данные о возможности развития диабета у других позвоночных и даже беспозвоночных животных, тем более что у них, так же как и у млекопитающих, выявлены все основные компоненты инсулиновой сигнальной системы, повреждения которой являются одной из главных причин диабета.

Создание моделей сахарного диабета у беспозвоночных животных является одним из перспективных подходов для изучения молекулярных основ развития этого заболевания. Необходимость создания и изучения таких моделей связана, в частности, с тем, что некоторые биохимические, физиологические и поведенческие показатели у беспозвоночных контролировать намного легче, чем у млекопитающих, которые являются классическими объектами для создания моделей диабета.

Ранее в лаборатории молекулярной эндокринологии Института эволюционной физиологии и биохимии была создана модель стрептозотоцинового диабета у двустворчатого моллюска Anodonta cygnea. Было показано, что в процессе развития диабетоподобного состояния в мышцах этого моллюска на фоне резкого повышения уровня сахаров в гемолимфе (гипергликемии) снижается ответ гормоночувствительной аденилатциклазной системы к инсулину и другим пептидам инсулинового суперсемейства. Основные нарушения в передаче гормонального сигнала и чувствительности тканей к инсулину отчетливо выявлялись уже через 2 суток после введения моллюскам стрептозотоцина. В дальнейшем, через 4 и 8 суток чувствительность к гормонам начинала восстанавливаться.

В плане создания новых моделей диабетоподобных состояний у беспозвоночных была разработана стрептозотоциновая модель диабета у представителей брюхоногих моллюсков – прудовика Lymnaea stagnalis и катушки Coretus corneus. Экспериментальная модель диабета на брюхоногих моллюсках вызывалась однократным введением им стрептозотоцина в дозе 65 мг/кг веса животного.

Цель работы состояла в изучении чувствительности фермента аденилатциклазы, эффекторного компонента аденилатциклазной сигнальной системы, к гормональным и негормональным активаторам в мышцах и гепатопанкреасе моллюсков со стрептозотоциновым диабетом в сравнении с контрольными животными.

Методика исследования

Животных собирали в ленинградской области. У собранных животных мы извлекали мышцы и гепатопанкреас, после чего полученные органы гомогенизировали. Полученный гомогенат мы два раза центрифугировали. Первый раз при 15000 оборотах в течение 15 минут, а второй раз при 20000 оборотах в течение 30 минут для осаждения плазматических мембран. Полученные мембраны добавляли в инкубационную среду следующего состава: 50 мМ Tris-HCl, pH 7.5, 0.1 мМ АТФ, 1 мМ цАМФ, 20 мМ креатинфосфата, 0.2–0.5 мг/мл креатинфосфокиназы, 5 мМ MgCl2, [a-32P]АТФ добавляли из расчета 1-2 мкКи на пробу. Общий объем пробы составлял 50 или 100 мкл. Определение активности магний-зависимой АЦ (АТФ-пирофосфатлиазы циклизующей, КФ 4.6.1.1) проводили при 30 °C и времени инкубации 10 мин по модифицированному нами методу (Salomon et al., 1974). Реакцию начинали добавлением белка (15–50 мкг), а останавливали внесением в пробу 200 мкл 0.5 М HCl, после чего образцы помещали на 7 мин в кипящую водяную баню, затем в каждую пробу вносили по 200 мкл 1.5 M имидазола и наносили образцы на колонку с окисью алюминия. Образовавшийся в ходе ферментативной реакции цАМФ элюировали с помощью 8 мл 10 мМ имидазол-HCl буфера, pH 7.4. Элюат помещали в сцинтилляционные флаконы и в них измеряли радиоактивность по методу Черенкова на счетчике Rackbeta (LKB, Швеция). Активность АЦ выражали в пмоль цАМФ/мин на 1 мг белка.

Полученные результаты

Одной из задач исследования было изучение динамики нарушений, возникающих в АЦ системе, и способность этой системы к восстановлению сигнал-проводящей функции, для чего были выбраны различные сроки развития диабета – от одних до пяти суток после введения животным стрептозотоцина. Для выяснения того, как в условиях диабетоподобного состояния в тканях моллюсков меняется активность аденилатциклазных сигнальных систем, сопряженных с различными типами G-белков, изучали передачу гормональных сигналов, осуществляемую как через G-белки стимулирующего (Gs-белки), так и ингибирующего типа (Gi-белки).

В мышечных тканях обоих моллюсков через сутки после обработки стрептозотоцином на фоне отчетливо выраженной гипергликемии в сравнении с контролем повышалась базальная активность аденилатциклазы и снижалась ее чувствительность к стимулятору G-белков – GppNHp (негидролизуемому аналогу ГТФ) (табл.1). При более продолжительном развитии диабета (3 и 5 суток) базальная активность АЦ и ее регуляция GppNHp практически не отличались от контроля. Это происходило на фоне существенного снижения уровня сахаров в гемолимфе, который через 3 суток приближался к его значениям в контроле.

В гепатопанкреасе прудовика различия были выражены в большей степени, сохранялись при диабете со сроком развития 3 суток, но мало отличались от контроля через 5 суток после обработки стрептозотоцином (табл.1). В отличие от мышечной ткани прудовика, в гепатопанкреасе наблюдали снижение (а не повышение) базальной активности аденилатциклазы, а также отчетливо выраженное ослабление стимуляции фермента форсколином, который действует непосредственно на фермент.

Таблица 1. Базальная активность аденилатциклазы и ее стимуляция негормональными агентами в мышцах и гепатопанкреасе моллюсков прудовика L. stagnalis и катушки C. corneus с диабетом со сроками развития 1, 3 и 5 сут в сравнении с контрольными животными

ВоздействиеАктивность АЦ, пмоль цАМФ/мин на 1 мг мембранного белка(M ± m)   
 КонтрольДиабет (сут)  
  1 35
L. stagnalis, мышцы
Без воздействий42 ± 2 (100)57 ± 3 (100)46 ± 3 (100)40 ± 4 (100)
GppNHp, 10-6 M155 ± 9 (369)130 ± 8 (228)144 ± 11 (313)149 ± 12 (373)
Форсколин,10-6 M120 ± 4 (286)131 ± 10 (230)125 ± 7 (272)113 ± 6 (283)
L. stagnalis, гепатопанкреас
Без воздействий75 ± 6 (100)59 ± 8 (100)64 ± 3 (100)70 ± 5 (100)
GppNHp, 10-6 M157 ± 8 (209)85 ± 4 (144)ND129 ± 11 (184)
Форсколин,10-6 M210 ± 7 (280)126 ± 11 (214)144 ± 10 (225)186 ± 9 (266)
C. corneus, мышцы
Без воздействий25 ± 1 (100)33 ± 3 (100)26 ± 3 (100)23 ± 1 (100)
GppNHp, 10-6 M69 ± 4 (276)58 ± 2 (176)62 ± 5 (238)63 ± 7 (274)
Форсколин,10-6 M60 ± 2 (240)68 ± 4 (206)64 ± 7 (246)61 ± 6 (265)

Примечание. В скобках приведена активность АЦ в процентах (базальная активность фермента для каждой группы животных принята за 100 %).

Стимулирующие аденилатциклазу эффекты биогенных аминов (октопамина, дофамина и серотонина) и пептидного гормона релаксина, которые действуют через Gs-белки, отчетливо снижались в мышцах обоих видов моллюсков с диабетом продолжительностью 1 и 3 суток (табл.2). Через 5 суток эти эффекты в значительной степени восстанавливались, в случае серотонина – до их уровня в контроле.

Таблица 2. Стимулирующие аденилатциклазу эффекты гормонов в мышечной ткани моллюсков Lymnaea stagnalis (а) и Coretus corneus (б) с диабетом в сравнении с контрольной группой животных.

Гормон Активность АЦ, %   
 КонтрольДиабет (сут)  
  135
(А) L. stagnalis (мышцы)
Октопамин578 ± 31298 ± 17460 ± 12513 ± 39
Дофамин341 ± 19242 ± 14288 ± 11307 ± 17
Серотонин694 ± 29401 ± 26558 ± 35670 ± 28
Релаксин216 ± 9168 ± 9187 ± 12198 ± 11
(Б) C. corneus (мышцы)
Октопамин426 ± 17304 ± 17366 ± 20393 ± 26
Дофамин236 ± 10181 ± 7199 ± 10211 ± 14
Серотонин517 ± 31350 ± 23463 ± 35510 ± 31
Релаксин169 ± 6140 ± 5155 ± 9157 ± 9

А – октопамин, Б – дофамин, В – серотонин, Г – релаксин. 1 – контроль, 2–4 – диабет со сроком развития 1, 3 и 5 суток. Базальная активность фермента принята за 100 %.

Сходные тенденции были выявлены в гепатопанкреасе катушки с той лишь разницей, что стимулирующие аденилатциклазу эффекты биогенных аминов (октопамина и серотонина) в этой ткани снижались в значительно большей степени, чем в мышцах, и даже через 5 суток восстанавливалась только до 60–70 % от их величины в контроле (табл.3). Это указывает на более выраженные нарушения чувствительности к гормонам, действующим на аденилатциклазу через Gs-белки, в гепатопанкреасе моллюсков с диабетом в сравнении с их мышечной тканью.

Таблица 3. Стимулирующие аденилатциклазу эффекты биогенных аминов в гепатопанкреасе C. corneus с диабетом в сравнении с контролем.

Гормон Активность АЦ, %   
 КонтрольДиабет (сут)  
  135
(Б) C. corneus (гепатопанкреас)
Октопамин687 ± 46290 ± 20324 ± 16464 ± 31
Серотонин404 ± 22210 ± 19246 ± 11307 ± 25

А – октопамин, Б – серотонин, 1 – контроль, 2–4 – диабет со сроком развития 1, 3 и 5 суток. Базальная активность фермента принята за 100 %.

В мышцах катушки пептидный гормон соматостатин отчетливо ингибирует стимулированную форсколином активность АЦ (табл.4). В условиях суточного диабета ингибирующий АЦ эффект соматостатина резко ослабляется, но к 5 суткам восстанавливается до его значений в контроле. Таким образом, несмотря на резкое снижение чувствительности к соматостатину сопряженной с Gi-белками аденилатциклазной системы в мышцах катушки на начальных этапах развития диабета, в дальнейшем наблюдается быстрое ее восстановление – частичное через 3 суток и полное через 5 суток после обработки стрептозотоцином.

Таблица 4. Ингибирование соматостатином стимулированной форсколином АЦ активности в мышцах C. corneus с диабетом в сравнении с контролем.

ГормонСтимулирующий АЦ эффект форсколина, %   
 КонтрольДиабет (сут)  
  135
(Б) C. corneus (мышцы)
Соматостатин32 ± 487 ± 665 ± 338 ± 6

1 – контроль, 2–4 – диабет со сроком развития 1, 3 и 5 суток. Стимулирующий АЦ эффект форсколина (10-5 М) в отсутствие соматостатина принят за 100 %, p меньше 0.05 по сравнению с контролем.

Полученные данные свидетельствуют о том, что после обработки стрептозотоцином в тканях моллюсков запускаются процессы восстановления чувствительности аденилатциклазной системы к различным по химической природе гормонам, действующим как через Gs-, так и через Gi-белки. В основе этого лежит выраженная способность к регенерации у беспозвоночных животных тканей, продуцирующих инсулиноподобные вещества. Повышение уровня таких веществ, обладающих гипогликемическим эффектом, приводит к снижению уровня сахаров в гемолимфе. Поскольку гипергликемия является одним из ключевых факторов, ведущих к нарушению функционирования гормональных сигнальных систем, то снижение уровня сахаров способствует восстановлению чувствительности этих систем к гормонам. Так как в нашем случае через трое суток уровень сахаров в гемолимфе диабетических моллюсков снижался до контрольного уровня, можно утверждать, что гипергликемия является одним из ключевых факторов, ведущих к нарушению функционирования аденилатциклазной системы у моллюсков с диабетом.

Выводы

1. В мышцах и гепатопанкреасе моллюсков с диабетом, вызванным обработкой стрептозотоцином, снижался стимулирующий аденилатциклазу эффект гуанилилиимидодифосфата (GppNHp), действующего на гетеротримерные G-белки, а в гепатопанкреасе также снижался стимулирующий эффект форсколина, действующего непосредственно на аденилатциклазу, причем нарушения были наиболее выражены через сутки после развития диабета.

2. У моллюсков со стрептозотоциновым диабетом продолжительности одни сутки отчетливо снижались регуляторные эффекты биогенных аминов и пептидных гормонов, реализуемые как через G-белки стимулирующего (октопамин, дофамин, серотонин, триптамин и релаксин), так и ингибирующего типа (соматостатин). В дальнейшем, через трое и пятеро суток после обработки стрептозотоцином, наблюдалось восстановление этих эффектов. Нарушения в гепатопанкреасе были выражены в большей степени в сравнении с мышцами.




Рис. 1. Стимулирующие аденилатциклазу эффекты гормонов в мышечной ткани моллюсков Lymnaea stagnalis (а) и Coretus corneus (б) с диабетом в сравнении с контрольной группой животных.
А – октопамин, Б – дофамин, В – серотонин, Г – триптамин, Д – релаксин. 1 – контроль, 2–4 – диабет со сроком развития 1, 3 и 5 суток. Базальная активность фермента принята за 100 %.




Рис. 2. Стимулирующие аденилатциклазу эффекты биогенных аминов в гепатопанкреасе C. corneus с диабетом в сравнении с контролем.
А – октопамин, Б – серотонин, В – триптамин, 1 – контроль, 2–4 – диабет со сроком развития 1, 3 и 5 суток. Базальная активность фермента принята за 100 %.




Рис. 3. Ингибирование соматостатином стимулированной форсколином АЦ активности в мышцах C. corneus с диабетом в сравнении с контролем.
1 – контроль, 2–4 – диабет со сроком развития 1, 3 и 5 суток. Стимулирующий АЦ эффект форсколина (10-5 М) в отсутствие соматостатина принят за 100 %. *p


Список литературы

Шпаков А. О., Кузнецова Л. А., Плеснева С. А. И др. Бюл. Экспер. Биол. Мед. 144, 526-530 (2007).
Shpakov A. O., Kuznetsova L.A., Plesneva S. A. et al. Cent. Eur. J. Biol. 1, 530-544 (2006).
Londos C, Salamon Y, Lin MC, Harwood JP, Schramm M, Wolff J, Rodbell M. Anal Diochem. 1974 Apr;58(2):541-8.


 

©2007-2020 Бюро инновационных технологийcms4site™